在第一次“华山论剑”中,“中神通”王重阳赢得武功秘笈《九阴真经》。周伯通跟随王重阳来到”南帝“段智兴所在的大理王宫,在段智兴与王重阳切磋武功期间闷得发慌便在王宫到处游荡。
在宫中发现了练武的刘贵妃即后来的瑛姑,后来传授她点穴功夫。但也因此肌肤相接,日久生情,使得瑛姑怀孕。后来段智兴知道后决定将瑛姑许配给周伯通,但周伯通坚决不肯,还了锦帕给了瑛姑,随即离开。
数年后王重阳逝世,死前交代周伯通将经书上下册分开藏匿。周伯通在运送《九阴真经》下册至藏匿地点的途中遇到“东邪”黄药师与其新婚妻子冯蘅,黄夫人设计骗得《九阴真经》下册经文的内容,周伯通中计下毁去经书。日后周伯通得知其受骗于黄药师夫妇二人,为防上册经书被盗,于是携带《九阴真经》上册经书前往黄药师居所桃花岛追讨下册经文,却因武功不敌黄药师,从此被困于岛上十五年。
这期间周伯通为打发时间自创七十二路“空明拳”及“双手互搏”,同时也熟读《九阴真经》上册经文,另外也偶然从郭靖处取得下册经文。
天真烂漫的周伯通与郭靖成为结拜兄弟,并且授予他“空明拳”及“双手互搏”的功夫,出于作弄心理周伯通在未告知郭靖的情形下要他详记《九阴真经》的经文内容,同时也教导其《九阴真经》的武功,只是周伯通自己也在不知不觉的情形下学会了《九阴真经》上所记载的武功。
在郭靖赢得黄药师的三场比试之后,周伯通与郭靖、洪七公离开桃花岛。在与欧阳锋打赌后不愿写出《九阴真经》而跳入海中,但遇到一只鲨鱼而后骑鲨遨游直至再次遇到郭靖等人。
第二次华山论剑时,周伯通捉住沙通天等人,并将他们交予丘处机关在重阳宫。而后见到瑛姑来到,便迅速离开了华山之巅。
随后十余年在蒙古游荡,并传授耶律齐武艺。
后来周伯通被赵志敬和金轮法王骗入蜘蛛洞,幸得小龙女用玉蜂为其解毒,随后他传授双手互博之术给小龙女,从而化解了危机。但周伯通看到指挥蜜蜂好玩便偷了小龙女的玉蜂蜜,学习指挥玉蜂。
周伯通的武功在金庸的武侠小说《射雕英雄传》和《神雕侠侣》中属于顶级水平。武功水平非常高,甚至能够不败于五绝中的东邪、西毒、南帝、北丐和中神通。
周伯通和王重阳的关系是师兄弟。周伯通是王重阳的师弟,全真七子的师叔。虽然他们的关系被称为师弟,但实际上周伯通的武功都是王重阳所教。周伯通是王重阳未出家前的结拜兄弟,也是全真教的忠实信徒。